مطالعه تنوع ژنتیکی گیاه ختمی با استفاده ازمارکر مولکولی rapd و بررسی میزان اسانس موجوددرتوده های مذکور و تاثیر عصاره اتانلی ریشه آن روی باکتری استرپتوکوک پیوژن در مقایسه با داروهای آنتی بیوتیکی موجود.

مقدمه ختمی یکی از مهمترین گیاهان دارویی لعاب دار و عضوی از خانواده پنیرکیان1 که از لغت یونانی malake به معنی نرم گرفته شده است، می باشد . این خانواده دارای پنج جنس به نامهای: malva ,lavatera ,althaea ,alcea و abutilon می باشد که جنس اخیر درغرب آفریقا گزارش شده است. گونه ختمی دارویی2 یکی از گیاهان شاخص تیره ختمی است. درباره نام آن: althea از لغت یونانی altho به معنی شفا دادن گرفته شده و پسوند officinalis (اسم گونه) نشان دهنده دارویی بودن گونه مورد نظر است. ختمی ، گیاهی علفی پایا با ریشه منشعب زرد رنگ و ساقه بلند افراشته پوشیده از برگهای متناوب می باشد. تمام نقاط گیاه دارای کرکهای نرم بوده و از بغل برگها، خوشه های گل سفید یا صورتی ظاهر می شوند[137]. همه قسمت های این گیاه (برگ، گل، ریشه) خواص دارویی دارد. به این منظور ریشه ها را در اسفند و فروردین ماه یا مهر و آبان ماه و گلها را در تیر و مرداد ماه و سرانجام برگ ها را قبل از شکفتن گلها محصول برداری می کنند. این گیاه به دلیل خواص دارویی شگفت انگیز خود از سال ها پیش در طب سنتی کاربرد داشته است[137]. اهمیت بالای این گیاه دارویی به دلیل وجود موسیلاژها3- مواد پکتینی4- تانن ها5- اسکوپولتین6[16،17] - فلاوونوئیدها 7شامل (کورسیتین8)- لاکتونها مانند (کومارین9)- آنتوسیانین ها10- سیانیدین11- استرها12 مانند (سالیسیسلیک) و اسیدهای پلی فنولیک13 به عنوان ت (سیرینژیک - کافئیک – وانیلیک ) می باشد[40،39].این گیاه امروزه در صنایع مختلف از قبیل پزشکی، عطرسازی، مواد آرایشی وصنایع غذا یی استفاده می‎شود.عصاره گیاه ختمی جهت درمان تحریک مخاط دهان و حلق همراه با سرفه های خشک[9، 114] همچنین در درمان التهابات دستگاه گوارش و تنفس[7]، سرفه های تحریکی و برونشیت کاربرد دارد [48].در حیوانات اثر ضد سرفه عصاره کامل و پلی ساکاریدهای ریشه ختمی با داروهای غیر مخدر سرکوب کننده سرفه مقایسه شده و بر اساس نتایج این بررسی تجویز پلی ساکاریدها موجب کاهش قابل توجه آماری در تعداد سرفه ها و مهار رفلکس سرفه شده و اثر عصاره کامل کمتر از پلی ساکاریدها بوده است[107]. همچنین ترکیبات موجود در ختمی باعث تحریک فاگوسیتوز و محرک ایمنی می باشند[90]. این گیاه با ارزش دارویی در بسیاری از نقاط کشورمان به صورت خودرو می روید.تنوع ژنتیکی گیاهان طی هزاران سال ایجاد شده ودر طبیعت به صورت پایدار باقی مانده است. توده های بومی یک گیاه ، ژرم پلاسم مناسبی برای برنامه های اصلاحی می باشند[113]. منابع اولیه ژن های مفید در صورت جمع آوری می توانند برای همیشه نگهداری شده و در صورت نیاز مجددا مورد بهره برداری قرار گیرند. بانک های ژن با جمع آوری ، شناسایی و ارزیابی دقیق و حفاظت ذخایر توارثی ، به برنامه های اصلاحی کمک می نماید. تنوع ژنتیکی در کشاورزی به دلیل یافتن ژنوتیپ پر محصول از نظر کاربردی مورد توجه می باشد. روش های متداول اصلاح گیاهان بر اساس انتخاب ژنوتیپهای مطلوب از بین جوامع با تنوع ژنتیکی می باشد، بنابراین آگاهی از تنوع جمعیت پیش شرط اصلی در اصلاح گیاهان می باشد[141]. از دلایل ایجاد تنوع در جمعیت های گیاهی می توان از جهش ، نوترکیبی جنسی ، رانده شدن ژنتیکی و گزینش ، مهاجرت و جریان ژن نام برد. اطلاع از روابط خویشاوندی و تنوع ژنتیکی بین توده های مناطق مختلف ، اولین مرحله از کارهای اصلاحی بر روی گیاه دارویی ختمی می باشد. وجود تنوع زیاد مرفولوژیکی این گیاه در مناطق مختلف کشور، نشان دهنده تاثیر زیاد عوامل محیطی بر بروز این صفات می باشد. بنابراین در گیاه دارویی ختمی با استفاده ار این تنوع و تولید ارقام اصلاح شده ، می توان باعث افزایش عملکرد در واحد سطح شد. درحال حاضر برای بررسی تنوع ژنتیکی وگروه بندی گونه های مختلف دارویی ازمارکرها (نشانگرها)ی مولکولی استفاده گسترده ای شده است[136، 145، 150]. نشانگرrapd ازجمله نشانگرهای مبتنی برpcr است که ضمن سهولت در استفاده ازآن، نیاز به استفاده از مواد رادیواکتیو نداشته و برای انجام آن به مقدار کمی dna ژنومی نیاز است. در این روش با استفاده از آغازگرهای کوتاه ده نوکلئو تیدی و دمای پایین برای اتصال این آغازگرها به dnaی الگو بدون نیاز به دانستن توالی آن، می توان شرایط را برای تکثیر غیر اختصاصی و تصادفی قطعات فراهم کرد. به این ترتیب که این آغازگرها بر اساس شباهت توالی آنها به توالی های تصادفی dnaی هدف متصل شده و آن قطعات را تکثیر می کنند. این روش علیرغم تکرارپذیری کم ،یکی ازروش های مناسب برای شناسایی چند شکلی ها و تعیین تنوع ژنتیکی است[109]. همچنین با این روش امکان جمع آوری داده برای تعداد زیادی از آلل ها وجود دارد و در سیستم های زیادی قابل استفاده است. این نشانگر برای تعیین تنوع ژنتیکی بسیاری ازگیاهان مانند گندم[136]، زیره پارسی[151]، بنگ دانه[150]، و غیره استفاده شده است. با بررسی تنوع در توده های ختمی تفکیک و طبقه بندی آنها می تواند کمک موثری در روند اصلاحی این گیاه به شمارآید. بنابراین با استفاده از بررسی تنوع ژنتیکی و اندازه گیری فاصله ژنتیکی بین نمونه های مختلف می توان به این هدف دست یافت و با به کار گیری در برنامه های اصلاحی به نتایج مطلوب تری رسید. روغن های فرار یا اسانس ها هم از نظر مقدار و هم از نظر ترکیبات سازنده تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی و درونی هستند. این پدیده علاوه بر اینکه از نظر مقدار تولید اسانس حائز اهمیت است، بلکه از جنبه های مختلف دیگر نظیر تغییراتی که در نوع اسانس و مقدار برخی از اجزای آن نیز به وجود می آید نیز جالب توجه می باشد. روشن شدن تاثیر عوامل محیطی مانند دما ، نور، رطوبت، موقعیت جغرافیایی ، خاک و ... چیزی را از نقش عوامل ژنتیکی که خود ممکن است تحت تاثیر محیط قرار گیرند کم نمی کند[139]. در تحقیقی به منظور بررسی چگونگی تاثیر عوامل غیر ژنتیکی بر تولید مونوترپن های گونه اوکالیپتوس کامادولنسیس ، علاوه بر تاکید مجدد بر نقش عوامل ژنتیکی بر میزان تولید مونوترپن ها و اسانس ، عوامل غیر ژنتیکی را نیز در این کار موثر دانسته اند[24]. عواملی مانند رطوبت خاک، استرس خشکی طولانی مدت که موجب کاهش تولید در برگهای جوان می شوند ، اما ظاهرا بر تولید برگهای بالغ تاثیر چندانی ندارند از آن جمله هستند. همچنین اشباع شدن خاک از آب موجب افزایش اسانس شده است[ 139]. تاثیر فاکتور های اکولوژیکی بر گیاهان بسیار چشمگیر است، به طوریکه از نظر بازده اسانس منطقه نورآباد سه برابراز تهران بیشتر است.در مقالات متعددی اثر مناطق مختلف اکولوژیکی بر تولید اسانس مورد بررسی قرار گرفته اند به طور مثال با مطالعه ای که در مورد اثر مکان و فصل برداشت برگ اسانس اوکالیپتوس های کاماندولنسیس و سیتیودو را انجام دادند ، به این نتیجه رسیدند که حداکثر تولید اسانس در دو منطقه مورد بررسی متفاوت بوده است[72] ونیز بیشترین مقدار در تولید اسانس در یک منطقه در فصل زمستان و در منطقه دیگر در فصل بهار بوده است [ 134]. اثرات دارویی اسانس ها روی دستگاه گوارش، التهابات پوستی و ... بسیار متنوع و زیاد است. با توجه به سازگاری این اسانس ها با بدن واثرات مفیدی که برای بدن دارند و با توجه به اثرات جانبی داروهای شیمیایی و افزایش روزافزون مقاومتهای انتی بیوتیکی[65] تعیین اثرات ضد استرپتوکوکی ( خصوصا استرپتوکوک های بتاهمولیتیک با گروه آنتی ژنی a) گیاهان دارویی می تواند گامی موثر در جهت معرفی اسانس و یا مواد خالص گیاهی برای همراه کردن و یا جایگزین کردن آنها با داروهای شیمیایی و سنتزی باشد که مقاومت میکروبی به آنها دیده شده است. استرپتو کوک ها از باکتری های گرم مثبت و گروه نا همگونی از باکتری ها هستند که هیچ سیستمی نمی تواند آنها را به طور کامل طبقه بندی کند. این باکتری ها دارای 20 سوش می باشندکه مهمترین آنها استرپتو کوکوس پیوژن نام دارد. استرپتو کوکوس پیوژن دارای آنتی ژن جدار سلولی مختص گروه a ( هیدرات کربن رامنوز - n استیل گلوکز آمین )می باشد و بتا همولیتیک است یعنی در محیط کشت آگار خوندار گلبولهای قرمز را به طور کامل لیز کرده و هموگلوبین را آزاد می کند [56]. درمورد گیاه ختمی اثر ضد باکتریایی آن در برابرسودوموناس ، پروتئوس ولگاریس1، استافیلوکوکوس ارئوس در سایت علمی مجیران گزارش شده است. دراین راستا اسانس تعدادی از گونه های مختلف گیاهان دارویی به منظورمقایسه ترکیبات تشکیل دهنده اسانس آنها و معرفی گونه های مناسب برای کشت و اهلی کردن و بهره برداری مورد مطالعه قرار گرفتند. در مطالعه ای در موسسه تحقیقات جنگلها ومراتع ، بررسی مقایسه ای اسانس بین گونه های مرزه ایران با جمع آوری گونه های مختلف مرزه از رویشگاههای طبیعی و خشک کردن در محیط آزمایشگاه واسانس گیری به روش تقطیرانجام شد. سپس توسط کروموتوگرافی گازی تجزیه ای1و گاز کروموتوگراف متصل به طیف سنجی جرمی ((gc/ms اندیس های بازداری محاسبه و مورد شناسایی قرار گرفت[139]. دررابطه با تاثیر اسانسها یا عصاره های گیاهی بر روی میکروارگانیزم ها نیز تحقیقات زیادی شده است. از جمله بررسی نقش ضد باکتریال اسانس پرتغال بر روی باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری در بیماران مبتلا به ضایعات پوستی در دانشگاه شهید بهشتی تهران انجام شد نشان داد که با توجه به حساس بودن باکتریها به این اسانس می توان از آن به عنوان یک ضدعفونی کننده در سطح پوست استفاده نمود[147]. در تحقیق دیگری اثرضد هلیکو باکترپیلوری عصاره های آبی و متانولی زیره سبز2 و ترخون3 درشرایط آزمایشگاهی انجام شد. طی این مطالعه این نتیجه گیری حاصل شد که تحقیق درمورد محصولات طبیعی که مصرف آنها در طب سنتی برای ناراحتی های گوارشی گزارش شده، از نظر فعالیت ضد هلیکو باکتر با ارزش است. در این پژوهش مشخص گردید که ترخون و زیره سبز، رشد این باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار می کنند[149]. با توجه به مطالب گفته شده در این تحقیق ابتدا تنوع ژنتیکی گیاه ختمی با تکنیک 4rapd بررسی شده و توانایی این آغازگرها نیز برای تعیین تنوع ژنتیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس تنوع میزان اسانس در ارتفاعات مختلف مطالعه گردید. در نهایت اثرات ضد استرپتوکوکی گیاه در مقایسه با آنتی بیوتیکهای آموکسی سیلین5 ، اریترو مایسین6 و پنی سیلین7 مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به ارزش اقتصادی و صادراتی این گیاه دارویی، تا کنون گزارشی مبنی بر تحقیقات روی این گیاه منتشر نشده است. لذا پژوهش حاضر به منظور اهداف ذیل به اجرا درآمد: 1- معرفی این گیاه دارویی با ارزش بومی برای کشت وسیع و بهره برداری. 2- کمک به تکمیل بانک اطلاعاتی گیاهان دارویی ایران از طریق : الف- بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپ های ختمی دارویی با استفاده از نشانگرهای مولکولی .rapd ب- کارآیی نشانگر rapd در بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ های ارقام مورد مطالعه. ج-تخمین فاصله ژنتیکی و مدیریت ژرم پلاسم. د- بررسی اثر مهاری عصاره ریشه ختمی در مقابل باکتری استرپتوکوک پیوژنز هم به طور مستقل و هم در واکنش متقابل با برخی ازآنتی بیوتیک های رایج برای درمان عفونت های استرپتوکوکی. ذ- مطالعه تأثیر ارتفاع بر میزان اسانس گیاه ختمی.